Western blot 서비스 개요 : BITOIC

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Analysis service

Organoid service

Biomedical service

[service] 2-1. Western blot

2025-07-21

시험원리

1. 단백질 분리 (SDS-PAGE)

세포에서 추출한 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 분자량에 따라 분리합니다.
본 실험에서는 12% 겔이 사용되어 비교적 작은 크기의 단백질 분리에 적합합니다.

2. 단백질 전이 (Transfer)

분리된 단백질을 전기장을 이용하여 PVDF 멤브레인으로 이동(전이)시킵니다.
이 단계에서 단백질은 안정적으로 멤브레인에 부착되어 항체와의 반응이 가능해집니다.

3. 특이적 항체 결합

멤브레인의 비특이적 결합을 5% BSA로 차단(블로킹)한 뒤, 분석하고자 하는 표적 단백질에 특이적인 1차 항체와 반응시킵니다.
본 실험에서는 ERK, p-ERK, p38, p-p38, AKT, p-AKT, Smad2, p-Smad2, α-SMA 등 다양한 단백질을 1:500의 항체 희석비로 검출하였습니다.

4. 신호 증폭 및 검출

1차 항체에 결합된 2차 항체(HRP-conjugated)를 통해 신호를 증폭시킵니다.
이후 HRP 효소와 기질이 반응하여 발생하는 화학발광(Chemiluminescence) 신호를 검출하고, 이를 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 정량 분석합니다.

시험재료

1. 세포 및 처리물질

A549 세포 (사람 폐암 세포주)

DMEM, FBS (세포 배양용)

TGF-β1 (10 ng/mL) (세포 처리)

Rb (30 nM) (약물 처리)

2. 단백질 추출

Lysis buffer (단백질 추출용)

Protease/phosphatase inhibitor (단백질 안정화)

3. 전기 영동

12% SDS-PAGE gel (단백질 분리)

전기영동 완충용액 (Running buffer 등)

4. 전이 및 블로팅

PVDF 멤브레인 (단백질 전이용)

Transfer buffer

5% BSA (블로킹용)

TBS-T (Tris-buffered saline + Tween 20) (세척용 완충액)

5. 항체

1차 항체 (ERK1/2, p38, AKT 등) (희석비 1:500)

2차 항체 (HRP-conjugated) (희석비 1:500, 화학발광 검출용)

5. 검출 및 분석

ECL 키트 (Chemiluminescence 용)

ImageJ 소프트웨어 (밴드 정량 분석)